研究环状RNA翻译蛋白的核心思路与步骤 | 翻译组

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circRNA发挥生物学功能的8种方式

我们从2018年发表在Molecular Cell上的重量级综述说起，通讯作者是国内非编码RNA领域的大牛中科院生化所陈玲玲教授。这篇文章系统详实地展示了circRNA生源和功能的最新进展，并讨论了circRNA研究中的技术障碍。非常值得研究circRNA的小伙伴仔细拜读。

尽管大多数circRNA的功能仍然未知，但已知的功能包括吸附microRNA或蛋白质，调节转录并干扰剪接，甚至可以翻译产生多肽（图1）。

图1 环状RNA的8种生物学功能

逐一来看这8种功能：

在细胞核内

I：circRNA的加工影响其线性mRNA对应物（同源转录本）的剪接

一般而言，外显子环化越多，它出现在加工的mRNA中就越少。

II：circRNA可以调节其亲本基因的转录

尽管大多数环状RNA位于细胞质中，但是由内含子套索加工而来 (ciRNAs)或从滞留内含子的反向剪接(EIciRNAs)产生的环状RNA在人类细胞中是被限制在细胞核内的，已有报道，它们可以调控其亲本基因的转录。

III：circRNAs可以调节其线性同源转录本的剪接

因为circRNA（如CircSEP3）序列与亲本DNA序列有重复，滞留在核内的circRNA会以“负反馈回路调控”的方式，与亲本DNA形成RNA:DNA杂合链，直接阻断线性同源转录本的转录，导致可变剪接的发生。

在细胞质中

IV：circRNA可以充当miRNA海绵

这种作用方式是不是很熟悉，这就是我们讨论的ceRNA机制（点击菜单栏“绝对干货”，查看ceRNA专题内容）。这是目前大家研究和发表文章最多的circRNA作用机制，也是非常容易上手的circRNA研究。以ceRNA或competitive endogenous RNA为关键词，很容易找到相关的文章。

V：circRNAs通过结合蛋白发挥作用

circRNAs可以与不同的蛋白质相互作用形成特定的circRNPs，随后影响结合蛋白的作用方式，如circMbl，circFOXO3，circANRIL。

VI：circRNA翻译出多肽

绝大多数注释的circRNA主要位于细胞质中，于是产生了一个有趣的问题，它们是否能够翻译。由于circRNA既没有帽子也没有poly(A)尾巴，有人提出circRNA的翻译应该是以非帽子依赖的方式进行。要实现circRNA翻译，一种方式是通过IRES元件（Internal Ribosome Entry Sites）序列促进起始因子或核糖体与可翻译circRNA的直接结合，如circZNF609，circMbl。

除了IRES外，是否还有其他翻译机制？中科院上海生命科学研究院王泽峰教授的科研团队在2017年发表在《Cell Research》的文章（Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine）报道了RNA甲基化(m6A)也可以驱动circRNA翻译成多肽。circRNA翻译多肽发挥功能是目前研究的新热点，后面我们会重点说这个作用模式。

VII:：circRNAs发挥假基因的功能

在细胞外

VIII：circRNAs是很有前景的生物标志物

circRNA因其环状闭合抗RNase的特点，被认为是非常好的生物标志物。它在某些细胞分泌的外泌体中大量存在，发挥细胞间通信的作用。

以上介绍的8种circRNA在体内发挥功能的方式，每一个都是很好的研究方向。circRNA不只是讨论ceRNA作用方式，circRNA结合蛋白发挥功能，以及circRNA翻译成多肽发挥功能，都是能出高分文章的好故事。

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circRNA翻译出多肽或蛋白的代表性研究

说回正题，circRNA翻译多肽发挥功能这个研究角度值得重点关注。目前发表的文章还不多，但出来的文章水平都很高，下面列出的5项代表性研究工作，其中的研究思路非常值得借鉴。

1.m6A驱动环状RNA翻译

Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine. Cell Res. 2017. 27(5): 626. IF=15.393

2.CircRNA翻译

Translation of CircRNAs. Mol. Cell. 2017. 66(1): 9-21. IF= 14.248

3.circ-ZNF609可翻译蛋白并调控成肌细胞增殖

Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Mol. Cell. 2017. 66(1): 22-37. IF= 14.248

4.LINC-PINT环状形式编码肽抑制胶质母细胞瘤的致癌性转录延伸

A peptide encoded by circular form of LINC-PINT suppresses oncogenic transcriptional elongation in glioblastoma. Nat Commun. 2018. 9(1):4475. IF=12.353

5.circ-FBXW7可翻译蛋白并抑制神经胶质瘤肿瘤发生

Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis. J Natl. Cancer Inst. 2018. 110(3). IF= 11.238

作者前期研究发现含有IRES的circRNA能够在真核细胞内编码蛋白。然而后续实验意外地发现不含IRES的circRNA也能发生翻译。这预示着应该还有其他机制调控circRNA的翻译。

通过序列分析发现，不含IRES的circRNA在起始密码子附近存在RRACH motif，暗示m6A修饰可能驱动着circRNA的翻译。m6A motifs突变会导致翻译效率显著下降。

接着采用m6A测序全谱地筛选m6A修饰的circRNA，再结合生信分析筛选出含有长ORF（≥150 nt）具有翻译潜力的circRNAs，预测出25个circRNA可能具备翻译潜力。

要证明circRNA发生翻译，一个非常重要的证据是circRNA是否能和核糖体结合。作者采用翻译组技术Polysome profiling（点这里查看）发掘核糖体结合的RNA，从前面预测到的25个circRNA中筛选出10个circRNA与Polysome结合。

作者没有止步于此，继续深挖circRNA翻译的潜在机制，发现circRNA可通过METTL3/METTL14复合物（甲基化转移酶）进行m6A修饰，并通过FTO（去甲基化酶）去除m6A修饰。带有m6A修饰的circRNA接着通过募集YTHDF3蛋白（甲基化阅读蛋白）来招募eIF4G2蛋白和其他翻译起始因子，最后启动蛋白翻译。

再看这篇发表在Molecular Cell上关于circRNA翻译多肽的重要研究。

前期测序发现果蝇中含有大量内源性circRNA，其中大多数来自蛋白编码基因，并含有完整的外显子，它们是否能翻译？

作者从果蝇的核糖体印迹分析的测序数据中找到了一些circRNA结果，挖掘出与核糖体结合的37个候选circRNA，推测它们可能具备蛋白编码潜力。

作者选择Mbl基因为研究对象，构建出带V5标签的过表达circRNA载体（Minigene表达系统），然后验证这些circRNA的翻译性，并进一步构建将预测的ORF替换为Cherry荧光蛋白的载体来验证翻译能力。

找到circRNA与核糖体结合的证据才更具说服力。作者接着利用翻译组技术Ribosome Footprinting对果蝇头部组织进行分析，显示绝大部分核糖体印迹测序的Reads都位于标准阅读框区间，少数位于UTR区。共发现122个circRNA与核糖体结合（Ribo-circRNA）。

作者接着分析Mbl基因对应的circRNA可能翻译的蛋白序列。通过体外合成相应的肽段，做出质谱的标准图谱，并如预期地那样，在细胞产物的质谱数据中找出符合标准图谱的结果。

Mbl的一个环状RNA产物circMbl3（由该基因的外显子2-6环化形成）所翻译的肽段在标准图谱中找到了直接的质谱证据。这个肽段的序列与已知Mbl基因的各种Isoform编码的多肽序列都不同，可以确定是由circMbl3阅读框编码而来。

作者接着又对具备编码多肽能力的circRNA的特征进行了分析。通过分析151个Ribo-circRNA的5’UTR，发现约40%的可翻译circRNA与亲本基因共用起始密码子，Ribo-circRNA相对于其他circRNA更长，以便容纳下蛋白翻译调控序列；约72%的Ribo-circRNA具有cUTR。

由于circRNA不带5’帽子结构，因此它的翻译过程很可能是独立于5’帽子的。5’帽子依赖的翻译可被过表达的4E-BP蛋白抑制，为验证猜想，作者在果蝇细胞中过表达4E-BP蛋白观察对翻译的影响。结果表明过表达4E-BP蛋白显著抑制线性RNA编码的GFP报告基因翻译，但circRNA载体编码的则基本不受影响。作者又分别构建了circMbl、circCdi、circPde8和circTai的UTR序列的荧光素酶报告基因系统进行实验，获得了与前述实验吻合的结果。最后作者对circMbl所编码蛋白的功能进行了分析。

同一期另一项重要的研究，通过肌肉分化过程中的circRNA鉴定，发现了调控肌生成的circRNA（circ-ZNF609），与众不同的是，circ-ZNF609在这个过程中是可以翻译蛋白参与调控。感兴趣的童鞋可细致研读。

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研究circRNA翻译多肽或蛋白的3个关键步骤

最后，我们对研究circRNA翻译蛋白的套路做个提炼。

1） 分析circRNA是否具有翻译蛋白的结构特征。包括是否含有翻译起始相关的IRES，m6A motif，是否含有ORF。

2） 载体表达验证circRNA的翻译潜力。包括翻译启动元件是否发挥功能的验证实验和阅读框翻译产物的验证实验。

3） circRNA翻译多肽或蛋白的鉴定与功能分析，找到circRNA翻译的直接证据并研究功能。包括核糖体结合鉴定（重要的直接证据，常用Ribo-seq），翻译产物的鉴定（如制备特异性的抗体进行WB，质谱鉴定等实验），翻译产物过表达和敲低（或敲除）实验。

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